Решавање проблема за електрофорезу гела

Видео: Рефакторинг: шаблон проектирования Observer [Design Patterns]

Садржај

Упутства
Како
Обавештење
Шта ти треба

Електрофореза у полиакриламидном гелу, или ПАГЕ, је техника која се користи за одвајање органских молекула у биолошком узорку. Молекуле мање величине и тежине брже мигрирају у полиакриламидни гел када се примени електрична струја. Оштре различите траке се обично опажају након што се завршени гел инкубира на месту. Ово је релативно једноставан метод. Међутим, одсуство трака, трака које су мутне или које нису јасне, могу указивати на проблем у једном или више корака методе. Пратите основне смјернице за рјешавање проблема електрофорезе гела у којима резултати нису очекивани.

Упутства

Гел електрофореза је уобичајена метода за раздвајање протеинских или ДНК узорака (Јупитеримагес / Цомстоцк / Гетти Имагес)

Почните са завршним кораком гел електрофорезе и радите ретроактивно. За гел електрофорезу, последњи корак је поступак бојења који се користи за посматрање трака узорка. Неколико проблема би требало да се догоди током процеса бојења. Међутим, боја за бојење треба добро растворити у одговарајућем пуферу пре него што се користи за бојење гела. Проверите да ли је коришћена исправна концентрација боје.
Проверите извор напајања. Одсуство трака може значити да је струја или напонска конфигурација превисока и да узорци за тестирање мигрирају из гела. Висока подешавања такође могу проузроковати пребрзу миграцију компоненти узорка кроз гел, што доводи до лоше резолуције и нејасних опсега. Узорци можда неће мигрирати кроз гел ако је конфигурација извора енергије ниска. Узорци се такође могу акумулирати у бунару где су напуњени и не мигрирати кроз гел.
Проверите течни акриламид који се користи за конверзију полиакриламидног гела. Типично, проценат акриламида који се користи за конверзију полиакриламидног гела се креће од 5% до 15%. Узорци састављени од већих молекула се наносе на 5% гел, јер се велики фрагменти у гелу крећу спорије са већим процентом акриламида. Мали молекули се наносе на виши проценат гела, јер ниска концентрација гела не би могла да обради мање узорке.
Проверите реагенсе за полимеризацију акриламида. Полиакриламидни гел се формира полимеризацијом течне смеше која се састоји од бис-акриламида и акриламида. Амонијум персулфат и ТЕМЕД се додају у акриламид да се катализује формирање гела. Типично, акриламид треба да показује знаке полимеризације (формирање гела) 15 минута након додавања амонијум персулфата и ТЕМЕД-а. Полимеризација која се одвија веома брзо је резултат великих количина амонијум персулфата. Када није довољно, може изазвати непотпуну или неравномерну полимеризацију.
Потврдите количину учитаних узорака. Високе концентрације узорака могу се полако кретати кроз гел и смањити резолуцију траке. Ниска концентрација узорка не може се посматрати након што је гел обојен. Ове боје представљају ограничења на минималну количину узорка која се може визуелизовати као резултат осетљивости боје.
Потврдите квалитет учитаних узорака. Соли и други загађивачи присутни у узорку могу утицати на кретање узорка дуж гела. Електрофореза је резултат проласка електричне струје кроз гел који садржи пуфер проводне струје; високе концентрације соли у узорку могу утицати на кретање ове струје кроз гел. Када се изолује узорак, треба укључити комплет за пречишћавање да би се произвео релативно чист узорак.
Прегледајте литературу или писани протокол како бисте утврдили да ли је исправан "ПАГЕ" кориштен за извођење експеримента. Проценат акриламида у "ПАГЕ" је специфичан за величину узорка који се тестира. У литератури се такође могу дати специфичне информације о успостављању извора енергије и брзини миграције узорка.

Како

Наведене смјернице су опћените за примјену у биолошким истраживањима.
Приликом рјешавања било које лабораторијске процедуре, најбоље је почети са завршним кораком и радити ретроактивно како би се утврдио проблем.

Обавештење

При руковању акриламидом и полиакриламидом носите рукавице. Акриламид је неуротоксични реагенс и може се апсорбовати кроз кожу. Полиакриламид није неуротоксичан, али често садржи неполимеризовани акриламид и још увек се може сматрати токсичним.